VGF是一种非缩写型颗粒蛋白样蛋白质，在调节性分泌途径内完成包装和蛋白水解加工。VGF及其加工产生的肽段已被证实与学习、记忆、抑郁及慢性疼痛相关的神经可塑性有关。在感觉神经元中，外周神经损伤和炎症发生后VGF会迅速增加。由VGF羧基末端产生的若干生物活性肽具有脊髓促痛觉效应。本研究旨在考察TLQP-21肽的脊髓作用，并确认其是否参与持续性疼痛的脊髓机制。外源性TLQP-21应用在温水浸尾退缩试验中可诱导剂量依赖性热痛觉过敏。这种痛觉过敏可被p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂、环氧合酶抑制剂以及脂氧合酶抑制剂所抑制。研究人员采用TLQP-21免疫中和法探究内源性肽在持续性疼痛机制中的功能。在皮内注射完全弗氏佐剂的小鼠模型中，于炎症诱导前或诱导后5小时进行鞘内抗TLQP-21治疗，能剂量依赖性地抑制触觉过敏和热痛觉过敏。鞘内注射抗TLQP-21还能减轻神经病理性疼痛的保留神经损伤模型中触觉过敏的发展与维持。这些结果证明内源性TLQP-21肽参与炎症和神经损伤后的脊髓神经可塑性机制。
一、引言
VGF是一种非缩写型颗粒蛋白样神经肽前体，其表达受到神经损伤和生长因子的强烈调控。VGF及其蛋白水解加工产生的肽段已被证实参与能量平衡与代谢的调控，并与学习、记忆、抑郁及慢性疼痛相关的神经可塑性密切相关。
展开剩余94%含有VGF羧基末端的肽段（图1）可增强海马神经元培养物（如TLQP-62和AQEE-30）、海马切片（如TLQP-62）以及脊髓背角神经元（如TLQP-62）的神经活性。此外，鞘内注射C末端VGF肽段会引发热痛觉过敏（如AQEE-30）以及机械性和冷超敏反应（如TLQP-62）。VGF在感觉神经元和脊髓背角神经元中均有表达，且在外周炎症和神经损伤后迅速上调。一项针对20项神经病理性疼痛和炎症性疼痛模型微阵列研究的荟萃分析突显了VGF在慢性疼痛中的重要性：在2254个候选基因中，VGF是20项研究中超过三分之一均发现上调的7个基因之一；在这7个基因中，VGF又是通过因果证据证实与疼痛机制相关的3个基因之一（另外两个为神经肽Y和组织蛋白酶S）。这些发现共同表明，VGF及其衍生肽很可能在持续性疼痛状态的机制中起关键作用。
图1. VGF及其蛋白水解加工产生的C末端肽段TLQP-62、TLQP-21和AQEE-30的结构示意图。
除C末端肽段外，TLQP-62的加工还可产生TLQP-21肽段（图1）。自从脑提取物中被鉴定后，TLQP-21已被证实参与调节多种生理过程和行为，包括摄食、能量消耗、脂肪分解、胰腺激素分泌、应激反应和神经保护。此外，外源性皮内和脑室内注射TLQP-21可分别在福尔马林试验中增加或减少伤害性行为。然而，TLQP-21肽是否参与脊髓水平的疼痛信号传递尚不明确，且内源性TLQP-21的作用尚未得到评估。我们假设外源性TLQP-21具有脊髓促痛觉作用，且内源性肽参与持续性疼痛的脊髓机制。
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二、方法
所有动物实验均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的指导原则，并获得相关机构动物护理与使用委员会的批准。
01.抗TLQP-21抗血清
抗TLQP-21抗血清的制备方法如前所述。简言之，采用戊二醛将TLQP-21与牛甲状腺球蛋白偶联。将偶联物与等体积弗氏佐剂乳化后，以2周为间隔注射至雌性新西兰兔体内。使用Protein A层析柱对血清进行纯化，最终免疫球蛋白G（IgG）组分的蛋白浓度通过BCA法测定。抗TLQP-21 IgG的特征详情请参见结果部分。
02.斑点印迹分析
将肽段印迹至PVDF-FL膜，经甲醇活化、PBS冲洗后，用封闭缓冲液封闭1小时，加入一抗孵育过夜，PBS洗涤后与二抗孵育1小时，再次洗涤后使用成像系统检测。标记相对强度通过ImageJ软件量化。
03. 转基因小鼠
通过修饰先前描述的靶向载体，采用小鼠Vgf基因组序列、人类细菌人工染色体以及VGF基因组克隆，构建了人源化VGF敲入小鼠系。人类VGF编码序列位于单个两侧带loxP位点的外显子中。在Vgf多聚腺苷酸化信号下游1.2 kb处插入了一个选择性磷酸甘油酸激酶表达盒（两侧带有翻转酶重组靶点和loxP位点）。通过2.2 kb Sfi 1-Sph 1片段替换 comparable 的小鼠Vgf编码区及上下游非翻译区序列，该片段包含人类VGF编码区、5'UTR和3'UTR序列。插入的人类序列编码截短型人类VGF蛋白（氨基酸1-524），缺失多个C末端生物活性肽。这是通过引入已报道的VGF单核苷酸多态性（rs35400704）形成终止密码子而实现。将构建的人源VGF1-524靶向载体通过电转导入129Sv/J来源的R1胚胎干细胞。通过Southern印迹筛选出同源重组正确的G418抗性克隆，将其注射至C57BL/6囊胚产生嵌合体，最终从两个独立靶向克隆中获得生殖系传递的奠基鼠。
04.免疫组化分析
用异氟烷深度麻醉小鼠后，经心脏灌注无钙泰罗德氏液，随后灌注固定液（含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1 M磷酸缓冲液，pH 6.9），最后灌注含10%蔗糖的PBS溶液。取出的组织在4℃下经10%蔗糖溶液过夜处理后，进行冷冻切片（14微米）并贴附于明胶包被的载玻片上。切片经封闭缓冲液（含0.3% Triton-X 100、1%牛血清白蛋白、1%正常驴血清的PBS）预处理30分钟后，与一抗在4℃下孵育过夜，PBS冲洗后与二抗（1:300）在室温下孵育1小时，最后用含0.1%对苯二胺的PBS/甘油封片。使用的一抗包括：蛋白A纯化的兔抗TLQP-21（1:1000）和兔抗Iba1（1:1000）。
05.鞘内注射
采用直接腰椎穿刺法对清醒的成年ICR/CD-1远交系雄性小鼠（20-25克）进行鞘内注射。操作时轻柔固定小鼠髂嵴，使用连接50微升汉密尔顿注射器的30G针头，在L5-L6椎骨水平的蛛网膜下腔注入5微升注射物，注射过程持续1-3秒。每只小鼠操作时间约15-30秒。所有注射均由具有15-20年技术经验的研究人员完成。
06.热痛觉过敏评估
通过温水浸尾试验（49℃）收集小鼠鞘内注射前及注射后特定时间点的甩尾潜伏期数据。由不知实验分组的研究人员使用秒表记录甩尾潜伏期。抑制剂或IgG在实验前5分钟进行鞘内注射。通过计算Δ甩尾值（实验组甩尾潜伏期-基线甩尾潜伏期）进行数据分析。每组使用4-6只小鼠。应用的抑制剂包括：p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB202190（0.1和1 nmol/5微升）、环氧合酶抑制剂吲哚美辛（0.1和1 nmol/5微升）、5-脂氧合酶抑制剂AA-861（0.95和9.5 pmol/5微升）。所有动物均随机分配至各实验组。
07.机械感觉评估
使用IITC电子von Frey测痛仪检测机械反应。将小鼠置于玻璃观察箱内的金属网板上，适应15-30分钟后，用探头轻柔刺激后足底直至出现缩足反应，仪器自动记录压力值。
08.热感觉评估
将小鼠置于塑料观察箱内的玻璃平台上（IITC plantar analgesia meter），待其适应环境后，对后足底施加辐射热刺激，仪器自动记录缩足潜伏期。
09.持续性疼痛模型
所有实验均由不知分组的研究人员操作，且至少重复一次，结果均具有一致性。行为测试前动物需在测试环境中适应20分钟。
10.完全弗氏佐剂（CFA）炎症模型
在小鼠单侧后足底皮下注射30微升50% CFA的PBS溶液，对照组仅注射PBS。在注射后1、2、3、4、5、6及24小时测量机械阈值，同一动物在注射后6和24小时测量热退缩潜伏期。检测顺序为先进行von Frey测试，再进行后足辐射热测试。
11.保留神经损伤（SNI）模型
采用研究人员描述的方法诱导SNI模型。在异氟烷麻醉下暴露左侧坐骨神经及其三个终末分支，用5.0丝线结扎腓总神经和胫神经并在结扎远端切断，移除远端神经残端2-4毫米。假手术组仅暴露神经不作处理。在预处理实验中，于术前及术后2、6、14和21天测量机械缩足阈值；在后处理实验中，于术前及术后第12天（治疗前及治疗后1、2、3和24小时）进行机械阈值测量。
12.数据分析
采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。使用单因素方差分析或重复测量双因素方差分析，辅以Bonferroni事后检验。具体检验方法和P值标注于图注或结果部分。
三、结果
01.TLQP-21的脊髓效应及抗TLQP-21中和抗血清的特性
为确定TLQP-21的脊髓效应，对成年小鼠进行鞘内注射该肽段（图2）。在温水（49℃）浸尾试验中，TLQP-21可诱发剂量依赖性热痛觉过敏，效应在注射后60-90分钟达峰并持续近2小时。该效应可被MAPK p38抑制剂以及类二十烷酸合成酶COX和脂氧合酶抑制剂阻断。
图2. 外源性TLQP-21肽的脊髓效应。（A）鞘内注射TLQP-21在温水浸尾试验中诱导剂量依赖性热痛觉过敏。（B-D）p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB202190（B）、环氧合酶抑制剂吲哚美辛（C）和5-脂氧合酶抑制剂AA861（D）以剂量依赖方式减弱TLQP-21（3 nmol）诱导的热痛觉过敏（于TLQP-21鞘内注射后90分钟测量；P < 0.05，单因素方差分析，Bonferroni事后检验）。（A-D）每组3-6只小鼠。
采用TLQP-21诱导的热痛觉过敏模型评估抗TLQP-21中和抗血清（抗TLQP-21）的行为学特性。在TLQP-21肽段鞘内注射前5分钟注射等效剂量的抗TLQP-21或正常兔IgG（图3A）。预注射抗TLQP-21（而非正常兔IgG）可抑制TLQP-21诱导的热痛觉过敏。进一步评估抗TLQP-21对其他VGF衍生肽促痛觉效应的影响：预注射抗TLQP-21不影响鞘内给予AQEE-30（图3C）或延伸肽TLQP-62（图3D）诱导的热痛觉过敏，表明该抗体对TLQP-21具有选择性。为排除抗TLQP-21对脊髓痛觉传递的广泛抑制，评估了其对非VGF相关因子诱导的感觉反应的影响：预注射抗TLQP-21不影响鞘内注射N-甲基-D-天冬氨酸（0.3 nmol）诱导的热痛觉过敏（缩尾潜伏期变化：生理盐水预处理组 -2.92±0.16秒；抗TLQP-21预处理组 -3.12±0.26秒）或P物质（10 nmol）诱导的伤害性行为反应（反应次数：生理盐水组47±2次；抗TLQP-21组45.25±2.6次）。
图3. 免疫中和抗TLQP-21（抗TL21）的特性表征。（A）在TLQP-21注射前5分钟鞘内给予抗TLQP-21（而非正常兔免疫球蛋白G）可减弱TLQP-21诱导的热痛觉过敏（*P < 0.05，#P < 0.0001；重复测量双因素方差分析，Bonferroni事后检验，每组6只）。（B）抗TLQP-21抑制TLQP-21热痛觉过敏的时效曲线。在不同时间点（5分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、24小时）对分组小鼠进行抗TLQP-21鞘内预处理后注射TLQP-21，并于TLQP-21注射后90分钟（痛觉过敏高峰期）测量热痛觉过敏程度。抗TLQP-21的抑制作用在约3小时后迅速减弱。（C、D）抗TLQP-21预处理不影响AQEE-30（C）或TLQP-62（D）诱导的热痛觉过敏。（E、F）蛋白A纯化抗TLQP-21的斑点印迹分析表明，该抗体可特异性识别TLQP-21肽段，但不识别未加工的C末端母肽TLQP-62及其C末端产物AQEE-30。（G、H）抗TLQP-21可标记野生型小鼠背根神经节，但不标记表达C末端截短型VGF的小鼠。（A-D）每组3-6只小鼠。
通过在不同时间间隔预注射IgG后注射TLQP-21肽段，评估鞘内注射抗TLQP-21的中和活性持续时间（图3B）。当IgG与肽段注射间隔超过4小时后，抗TLQP-21对3 nmol TLQP-21诱导痛觉过敏的抑制作用显著减弱（1 nmol剂量实验结果类似）。最后测试抗TLQP-21对急性痛觉的影响：在梯度升温热刺激前注射该抗体，结果显示在各水温下（49℃、52.5℃、55℃）均未影响甩尾潜伏期。
斑点印迹分析证实：抗TLQP-21可剂量依赖性结合TLQP-21肽段，但不与延伸肽TLQP-62或其C末端组分AQEE-30结合（图3E-F）。通过野生型小鼠和表达C末端缺失型VGF（不编码TLQP-62）小鼠的背根神经节免疫组化实验进一步验证：抗TLQP-21标记存在于野生型感觉神经元中，而在截短型VGF小鼠中缺失（图3G-H）。上述行为学、印迹分析和免疫组化结果共同证实了抗TLQP-21的选择性。
02.TLQP-21免疫中和可减轻炎症性超敏反应
基于外源性TLQP-21的促痛觉效应，研究人员假设内源性肽段参与炎症性超敏反应。在足底注射CFA前或后5小时鞘内注射抗TLQP-21、正常兔IgG或生理盐水（图4）。CFA诱导的触觉超敏在注射后1小时出现，生理盐水和正常兔IgG预处理组的超敏程度在24小时测试期内持续存在（图4A）。虽然抗TLQP-21预处理在CFA后1小时未影响触觉超敏，但在后续时间点显著降低了超敏程度。在CFA后6和24小时，抗TLQP-21预处理还显著减轻了热痛觉过敏（图4B）。值得注意的是，热痛觉评估仅于6和24小时进行以避免刺激诱导的敏化和组织损伤。免疫中和对触觉和热觉反应的抑制均呈剂量依赖性（图4C-D）。进一步评估抗TLQP-21对已建立炎症超敏的抑制作用：在CFA注射后5小时鞘内注射抗TLQP-21，可显著减轻24小时时间点的触觉超敏和热痛觉过敏（图4E-F）。
图4. 抗TLQP-21对炎症诱导超敏反应的影响。（A、B）鞘内预注射抗TLQP-21可减轻足底注射完全弗氏佐剂（CFA）后触觉超敏（A）和热痛觉过敏（B）的发展。小鼠在CFA注射前立即鞘内注射生理盐水、抗TLQP-21（150 ng/5 μL）或正常兔免疫球蛋白G（150 ng/5 μL）。皮内注射生理盐水的对照组小鼠接受鞘内生理盐水预处理（生理盐水+生理盐水组）。在CFA注射同侧，抗TLQP-21预处理的CFA小鼠（而非正常兔IgG预处理组）的机械缩足阈值（A）和热退缩潜伏期（B）与生理盐水预处理的CFA小鼠存在显著差异（*P < 0.05，**P < 0.01，#P < 0.001，##P < 0.0001；重复测量双因素方差分析，Bonferroni事后检验；正常兔IgG组每组4只，其余各组每组8只）。（C、D）抗TLQP-21对CFA诱导触觉超敏（C）和热痛觉过敏（D）的抑制作用呈剂量依赖性。（E、F）抗TLQP-21治疗可减轻已建立的触觉超敏和热痛觉过敏。足底注射CFA后5小时（灰色箭头所示），小鼠鞘内注射生理盐水、抗TLQP-21（150 ng/5 μL）或正常兔IgG（150 ng/5 μL）。在CFA注射同侧，抗TLQP-21治疗组（而非正常兔IgG治疗组）CFA小鼠的机械缩足阈值（E）和热退缩潜伏期（F）在CFA注射后24小时与生理盐水治疗组存在显著差异（E：P < 0.0001；F：P < 0.001；重复测量双因素方差分析，Bonferroni事后检验；每组4只）。
03.TLQP-21免疫中和可减轻神经损伤诱导的超敏反应
采用SNI神经病理性疼痛模型评估内源性TLQP-21在神经损伤性超敏发生和维持中的作用。在SNI术前2小时内鞘内注射抗TLQP-21（非正常兔IgG）可显著降低术后第2天的超敏程度（图5A），且不影响假手术组的缩足阈值。单次预处理的抑制效果可持续2周（图5B）。进一步评估对已建立触觉超敏的抑制作用：在SNI术后第12天鞘内注射抗TLQP-21或正常兔IgG，治疗后3小时触觉超敏显著减轻且持续至24小时（图5C）。抗TLQP-21后处理不影响假手术组阈值。
图5. 抗TLQP-21对神经损伤诱导超敏反应的影响。（A）鞘内预注射抗TLQP-21可减轻保留神经损伤（SNI）后触觉超敏的发展。小鼠在SNI或假手术前立即注射生理盐水、抗TLQP-21（150 ng/5 μL）或正常兔免疫球蛋白G（150 ng/5 μL）。术后第2天，抗TLQP-21预处理的SNI小鼠（而非NR-IgG预处理组）的机械缩足阈值与生理盐水预处理的SNI小鼠存在显著差异。与生理盐水预处理的假手术组相比，抗TLQP-21未改变假手术小鼠的阈值（SNI生理盐水组 vs SNI抗TLQP-21组，P < 0.0001；假手术生理盐水组 vs 假手术抗TLQP-21组，P > 0.05；重复测量双因素方差分析，Bonferroni事后检验；均值±标准误，每组7-9只）。（B）抗TLQP-21预处理后超敏反应的时效变化。在SNI同侧，抗TLQP-21预处理的SNI小鼠（而非NR-IgG预处理组）的机械缩足阈值在神经损伤后14天内持续显著高于生理盐水预处理组（第2天P < 0.01；第6天和第14天P < 0.05；重复测量双因素方差分析，Bonferroni事后检验；均值±标准误，每组4只）。（C）抗TLQP-21治疗可减轻已建立的超敏反应。SNI术后12天，小鼠鞘内注射生理盐水、抗TLQP-21（150 ng/5 μL）或NR-IgG（150 ng/5 μL）。注射后3小时和24小时，抗TLQP-21治疗组（而非NR-IgG治疗组）SNI小鼠的机械缩足阈值与生理盐水治疗组存在显著差异（分别为P < 0.0001和P < 0.05；重复测量双因素方差分析，Bonferroni事后检验；均值±标准误，每组4只）。
四、讨论
本研究结果证实了VGF衍生肽TLQP-21具有脊髓促痛觉作用，并揭示了其在炎症性和神经损伤性疼痛模型中对脊髓神经可塑性的神经免疫调节作用。此外，有证据表明脊髓神经元存在C3aR1表达，提示TLQP-21可能在持续性疼痛状态下直接调控神经元活动。另有报道显示TLQP-21可与补体受体C1q的球状头端gC1qR结合，该相互作用参与神经损伤诱导的外周超敏机制。目前尚不清楚这两种补体受体（C3aR1与gC1qR）在TLQP-21生理效应中的相对贡献，且gC1qR在脊髓或感觉神经元中的表达及潜在功能仍有待研究。
01.外源性TLQP-21的脊髓促痛觉效应
与C末端VGF肽段AQEE-30和LQEQ-19类似，鞘内注射TLQP-21在温水甩尾试验中可诱导p38 MAPK依赖性热痛觉过敏。虽然TLQP-21的致痛强度与C末端肽段相当，但其时间进程更为延迟，提示可能激活了p38上游的不同信号机制。p38 MAPK抑制剂对TLQP-21痛觉过敏的抑制作用与小胶质细胞活化机制一致。此外，脂多糖刺激培养的脊髓小胶质细胞释放前列腺素E2需依赖p38激活。由于TLQP-21痛觉过敏可被COX抑制剂吲哚美辛抑制，表明其效应可能通过p38依赖性小胶质细胞前列腺素释放介导。但p38、其底物磷脂酶A2（可生成COX底物花生四烯酸）以及COX均存在于背角神经元中，因此不能排除TLQP-21直接作用于神经元介导热痛觉过敏的可能性。最后，5-脂氧合酶抑制剂对痛觉过敏的抑制作用表明白三烯合成通路也参与外源性TLQP-21的促痛觉效应，该物质此前已被证实参与脊髓痛觉信号传递。
02.内源性TLQP-21的免疫中和作用
采用免疫中和法探究内源性脊髓TLQP-21在持续性疼痛模型中的作用。经全面特性验证的抗TLQP-21抗体具有良好的特异性。我们推测该IgG可中和从初级传入末梢或内在神经元释放至脊髓实质的内源性TLQP-21。但由于TLQP-21推定受体C3aR1在脊髓中的表达特征尚未明确，不能排除抗TLQP-21通过其他位点起效的可能性，包括背根神经节（VGF肽可能参与神经元与卫星细胞的通讯）或硬膜下血管系统（涉及神经炎症过程）。
03.内源性TLQP-21参与炎症性超敏
在CFA炎症性疼痛模型中，无论于足底注射CFA前或后进行鞘内抗TLQP-21治疗，均可减轻触觉超敏和热痛觉过敏。值得注意的是，虽然抗TLQP-21预处理在CFA后1小时未影响触觉超敏程度，但后期显著降低其强度。数据还提示TLQP-21在该模型中对触觉超敏和热痛觉过敏的贡献可能不同：前者受抗TLQP-21影响更显著，反映TLQP-21在机械和热刺激脊髓处理中的不同作用。这些发现共同支持内源性TLQP-21在持续性炎症疼痛机制中的作用。既往研究报道CFA炎症后感觉神经元VGF上调，表明炎症条件下脊髓内源性TLQP-21可能来源于感觉神经元。外源性TLQP-21效应中p38和类二十烷酸的参与提示，p38依赖性类二十烷酸增加可能是内源性TLQP-21参与炎症性超敏的机制之一。
04.内源性TLQP-21参与神经损伤诱导的超敏
本研究结果还证实内源性TLQP-21参与神经损伤性超敏的发生和维持。单次预注射抗TLQP-21可使SNI诱导的触觉超敏完全表达延迟超过2周。基于该抗体对外源性肽的中和活性持续时间较短，这一发现表明预处理可能破坏了神经损伤初期数小时内发生的关键神经可塑性事件。但不能排除少量残存于脊髓实质的抗TLQP-21仍足以中和内源性释放肽段的可能性。在超敏建立后鞘内注射抗TLQP-21仍能有效减轻超敏程度，表明TLQP-21介导的信号通路在神经病理性疼痛维持期间持续激活。TLQP-21前体蛋白VGF在感觉神经元中的快速显著上调，提示神经损伤后背角TLQP-21释放可能增加。C3aR1作为TLQP-21受体的发现，表明TLQP-21可能作为损伤信号参与小胶质细胞活化。TLQP-21免疫中和后小胶质细胞内的特定信号组分（如P2X4、组织蛋白酶S或脑源性神经营养因子）是否发生变化仍有待阐明。
05.总结
本研究首次为内源性VGF肽参与持续性疼痛机制提供了功能性证据，支持VGF衍生肽在炎症和神经损伤后脊髓神经可塑性中起关键作用的观点。该信号系统同时参与超敏状态的发生和维持，表明VGF信号通路在慢性疼痛转化过程中具有重要作用。未来需进一步阐明TLQP-21与其他已知调控疼痛处理的C末端VGF肽之间的相互关系，明确其细胞与分子靶点及合成位点，以深入理解该系统的功能机制。
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